病毒和病毒成份的提纯剖析

第十四章病毒和病毒成份的提纯

一、病毒的提纯

（一）沉淀法

（二）层析法

（三）两相溶剂间分配系数法

（四）红细胞吸附法

（五）电泳法

（六）超速离心法

（七）超滤法

二、病毒蛋白亚单位的分离

三、病毒脂质的抽提

四、病毒糖类的抽提

一、病毒的提纯

所谓病毒提纯，就是应用各种物理、化学方法，以不使病毒受损伤和失活为前提，去除宿主细胞组分等非病毒杂质，提取出高纯度浓缩的病毒样品。病毒提纯是病毒学研究的重要前提，病毒微细形态结构的研究、病毒抗原蛋白的分离提纯、病毒化学成分及其遗传物质——dna或rna的详细研究都需要高纯度的病毒样品。

病毒纯度只是一个相对的概念，很难有绝对的标准，通常以下几点可以作为判定标准。

1.物理均一性

测定病毒样品的物理均一性，是证明其纯度的常用方法，包括电镜检查、病毒粒子沉降系数和扩散常数及其在凝胶电泳、等电聚焦中的迁移率等。

2.病毒滴度与蛋白含量的比例

测定病毒材料的感染力或其血清学反应滴度与其蛋白含量的比例，也是一种通常采用的纯度测定方法。病毒滴度对蛋白含量的比例越高，说明病毒的纯度越高。

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3.免疫学反应

免疫反应单一而无非特异反应，则说明病毒材料比较纯净。

4.结晶形成

病毒粒子在十分纯净的情况下，经常可以形成结晶，但少数混有杂质的病毒样品亦可形成结晶，所以这也只是一个相对标准。

病毒提纯的主要依据和条件有。（1）病毒只在活的细胞内寄生、复制和增殖，要在病毒不失活的前提下，使之从细胞中释放出来，去除细胞成份。有些病毒如痘病毒、正粘病毒、副粘病毒、披膜病毒，病毒粒子被释放到细胞外，可以从培养液或尿囊液中提纯；而另一些病毒如腺病毒、乳多空病毒、小dna病毒，在毒粒成熟后只有少数病毒释放到细胞外，大量提纯时必须首先裂解细胞，使病毒大量释放。实验室常用冻融、研磨、高速捣碎、超声波处理或高压冲击、中性去污剂裂解、蛋白酶解等物理和化学的方法。通过这些方法处理获得的粗制的病毒悬液，其中常含有大量的细胞碎片，一个有效的方法是以2000～6000r/min离心30～40分钟，可除去90％以上的细胞碎片和杂质。

（2）病毒粒子实际上是大的蛋白颗粒，可以应用提纯蛋白质的一些技术方法。（3）对大小、形状和密度高度一致的病毒粒子，可以采用分级分离的技术。当然不同的病毒，其生长特性及理化学性质不同，因此提纯方法也不尽一致。

（一）沉淀法

主要是从稀的悬浮液中浓缩病毒，有中性盐沉淀法、聚乙二醇（peg）沉淀法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、皂土法和鱼精蛋白沉淀法等。

1.中性盐沉淀法

病毒一般在45%以上饱和度的硫酸铵溶液中沉淀，且保持其感染性。在含有病毒的组织培养液中加入等体积的饱和硫酸铵，可以很容易地沉淀某些病毒如狂犬病毒、鸡新城疫病毒等。

2.聚乙二醇沉淀法

聚乙二醇（peg）为水溶性非离子型聚合物，具有各种不同的分子量，用于病毒沉的主要是分子量为2000～6000的peg。将peg配成50%左右的溶液，或直接将固体peg加于

235毒悬液中，使其达到所需浓度，通常在4℃搅拌过夜，然后离心使病毒沉淀。tanncock（1985年）成功地用peg浓缩了禽脑脊髓炎病毒。

3.有机溶剂沉淀法

甲醇、氯仿、正丁醇、氟碳化合物等都可用于提纯病毒，但乙醚、氯仿等脂溶剂对于具有脂质囊膜的病毒具有破坏和灭活作用，故不适于这类病毒的浓缩提纯。

4.等电点沉淀法